基于2A多肽策略的抗CD19嵌合抗原受体表达载体的构建与应用

• 作者: 吕佳妤 应芙蓉 林超 胡东伟 詹玲玲 赵志超 邓文海 陈闻捷 高基民
• 来源期刊: 中国免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: P2A 4-1BBL 慢病毒 内部核糖体进入位点 嵌合抗原受体的T细胞治疗技术
• 年，卷（期）: 2019,（13）
• 所属期刊栏目: 免疫学技术与方法
• 页码范围: 1595-1598,1603
• 页数: 5页
• 分类号: R392-3
• 字数: 3133字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-484X.2019.13.012

摘要

目的:构建最优的基于2A多肽策略的抗CD19嵌合抗原受体表达载体,为后期的B细胞恶性肿瘤临床治疗研究提供基础.方法:通过分子克隆技术构建pGIZ-EF1α-19CAR和4-1BBL表达载体,然后连接到pGIZ-EF1α-19CAR-P2A-4-1BBL表达载体中.将构建的重组质粒与两种包装质粒(psPAX.2和PMD2.G)共转染293T细胞以制备所需的慢病毒;MACS珠粒分选技术在分选健康人外周血T细胞时,利用antiCD2-antiCD3-antiCD28单克隆抗体磁珠加IL-2体外扩增培养T细胞;浓缩后的慢病毒感染T细胞,建立CAR-T细胞,利用流式细胞术检测19CAR和4-1BBL的共表达;通过细胞杀伤实验等手段检测CAR-T特异性杀伤细胞的功能.结果:①通过琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定构建的pGIPZ-19CAR-P2A-4-1BBL慢病毒表达载体构建成功.②19CAR-P2A-4-1BBL慢病毒转染293T细胞,制得CAR-T细胞,并利用流式细胞仪检测阳性细胞百分率,测定CAR的表达,流式结果表明CD19-CAR-构建成功,可以在细胞膜表面表达.③制备的病毒溶液感染T细胞.通过19CAR-IRES-4-1BBL和19CAR-P2A-4-1BBL感染T细胞后杀伤能力比较.两者均随效靶比的递增,细胞杀伤力变大,当CAR-T细胞与靶细胞比例达到40:1时,细胞裂解率达到90％左右.两者CAR-T细胞的细胞杀伤能力差异无统计学意义(P>0.05).结论:本课题成功构建了基于2A肽策略的慢病毒表达载体,通过转染获得所需病毒颗粒,慢病毒颗粒感染磁珠分选的T细胞获得抗CD19 CAR-T细胞,初步构建了治疗B淋巴细胞白血病的CAR-T技术平台.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	高基民		32	23	2.0	4.0
2	林超		9	16	3.0	3.0
3	詹玲玲		11	32	4.0	5.0
4	胡东伟		3	4	1.0	2.0
5	应芙蓉		6	28	3.0	5.0
6	吕佳妤		3	0	0.0	0.0
7	赵志超		1	0	0.0	0.0
8	陈闻捷		1	0	0.0	0.0
9	邓文海		1	0	0.0	0.0