摘要:
五环三萜化合物齐墩果酸(OA)与熊果酸(UA)为同分异构体,具有相似的理化性质和稍有差异的药理活性.目前人们主要采用各种色谱、质谱类方法实现对OA与UA的异构体识别,未见使用荧光光谱法的报道.提出了一种使用荧光猝灭法实现对OA与UA异构体识别的方法.首先考察了两种常见的血清蛋白—牛血清白蛋白(BSA )与人血清白蛋白(HSA )同OA与 UA的作用情况,结果表明OA与 UA均可有效地猝灭BSA与 HSA的荧光发射.对所得荧光猝灭数据计算可知OA ,UA与BSA ,HSA作用的双分子猝灭速率常数(Kq )均远大于生物大分子荧光猝灭所观察到的最大散射碰撞速率常数2.0×1010 L·(mol·s)-1 ,说明猝灭类型均为静态猝灭,即OA与UA均是通过与BSA及 HSA形成稳定复合物方式实现荧光猝灭的.应用双对数方程对所得荧光猝灭数据计算可知OA ,UA 与BSA ,HSA 所形成的复合物中结合位点数在0. 90~1. 26之间,说明所形成的复合物为1∶1型.BSA与OA ,UA所形成复合物的表观结合常数(KA )为同一数量级,相差不大,但是 HSA与OA ,UA所形成复合物的 KA 差别很大,HSA-UA复合物的KA比HSA-OA复合物高124.91倍,表明HSA-UA复合物的稳定性更强.同步荧光实验结果显示,OA与UA的加入对于HSA波长差(Δλ)为60 nm同步荧光光谱的影响大于 Δλ为15 nm的同步荧光光谱,由此可以说明OA与UA在HSA上的结合位点可能位于Trp残基附近.分子对接模拟计算结果表明OA与UA均对接在HSA结构中一个疏水性空腔中,主客体之间存在强烈的氢键与疏水作用. OA同Arg218 ,His242 ,Pro447等残基间存在氢键作用,键长分别为2.95 ,2. 97与3. 17 ?,此外还与Lys195 ,Lys199 ,T rp214 ,Arg222 , Leu238 ,Asp451和Tyr452等七个氨基酸残基间存在疏水作用.U A同T rp214 ,Arg218和Lys444等残基存在氢键作用,键长分别为3. 01 ,2.88与2. 65 ?,此外还与 Leu198 ,Gln221 ,Arg222 ,Asn295 , Val343 , Pro447 ,Cys448 ,Asp451和Val455等9个氨基酸残基间存在疏水作用.由于 UA同 HSA作用位点数目多于OA ,说明UA与HSA疏水性空腔的空间匹配程度更高.因此,认为HSA-UA与HSA-OA复合物间稳定性差异是HSA实现对OA与UA异构体识别的原因.