Sedlin突变体的表达及其与RB1在细胞中的共定位

• 作者: 何叶 刘晓颖 张永 潘林鑫 范礼斌
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 突变体 质粒构建 蛋白表达 免疫荧光
• 年，卷（期）: 2019,（10）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 1526-1531
• 页数: 6页
• 分类号: Q28|R392.7
• 字数: 4763字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2019.10.006

摘要

目的 构建脊椎骨骺发育不良蛋白(Sedlin)的缺失突变和点突变体质粒,检测其在细胞内的表达、定位及其与RB1蛋白的共定位情况,为后续研究蛋白质相互作用提供依据.方法 以Sedlin全长cDNA序列为模板,扩增目的基因序列,连接至表达载体,构建3个原核表达质粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相应的真核表达质粒,即pC-DGFP-SedlinN/Y115A/Y115F.分别转化pGEX-3 X-SedlinN/Y115A/Y115F到大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达、谷胱甘肽琼脂糖球珠纯化后进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色法检测其表达情况;分别转染pCDGFP-Sedl-inN/Y115A/Y115F于HEK 293T细胞,Western blot法检测相关蛋白在真核细胞中的表达情况;分别单转pCDGFP-Sedl-inN/Y115A/Y115F以及将上述质粒与pDNA3.1-FLAG-RB1共转到COS7细胞中,进行免疫荧光制片,观察其在真核细胞内的定位情况.结果 测序结果显示pGEX-3 X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F重组质粒构建成功;考马斯亮蓝染色显示融合蛋白GST-SedlinN/Y115A/Y115F在BL21细胞中能够大量表达;Western blot结果显示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F在HEK 293T细胞中能够高效表达;免疫荧光结果显示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F蛋白在COS7细胞的细胞质和细胞核中均有分布,并与RB1蛋白存在明显的核内共定位.结论 人Sedlin及其突变体在BL21菌株和HEK 293T细胞中均能有效表达;在COS7细胞中,Sedlin主要表达于细胞核,而Sedlin突变体除在细胞核中表达外,在细胞质中也有相当量的表达,Sedlin及其突变体均与RB1蛋白共定位,显示Sedlin羧基端以及NPFY基序中的Y磷酸化与否并不影响与RB1蛋白的共定位.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	范礼斌	安徽医科大学生命科学学院生物学系	53	174	8.0	9.0
2	刘晓颖	安徽医科大学生命科学学院生物学系	57	121	6.0	8.0
3	潘林鑫	安徽医科大学生命科学学院生物学系	19	40	3.0	5.0
4	张永	安徽医科大学生命科学学院生物学系	6	37	3.0	6.0
5	何叶	安徽医科大学生命科学学院生物学系	1	0	0.0	0.0