尼罗罗非鱼TRIF基因克隆及功能初步分析

• 作者: 刘志刚 刘洁 卢迈新 曹建萌 王淼 陈刚 韩雪晴 高风英
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 尼罗罗非鱼 β干扰素诱导型含TIR结构域的接头分子基因(TRIF) 基因克隆 表达分析 亚细胞定位
• 年，卷（期）: 2020,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 92-104
• 页数: 13页
• 分类号: S917.4
• 字数: 9234字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2020.06.010

摘要

β干扰素诱导型含TIR结构域的接头分子(TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)介导Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号传导途径中的下游信号传导,在宿主固有免疫应答中具有重要作用.为探究TRIF是否参与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)抗病免疫反应,本研究通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和分段扩增获得TRIF基因的cDNA(GenBank No.MT199561),并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,qRT-PCR)技术检测该基因在健康个体及无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和聚肌胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)刺激后的组织表达;进一步构建重组真核表达载体,分析TRIF在人(Homo sapiens)胚肾293T细胞的定位及对核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的激活作用.结果显示,尼罗罗非鱼TRIF cDNA全长3135 bp,其ORF为1653 bp,编码550个氨基酸.其蛋白质分子包含保守的Toll/IL-1受体(Toll/interleukin-1 receptor,TIR)结构域.系统进化树中,尼罗罗非鱼TRIF与其他鱼类成簇后再与斑马鱼(Danio rerio)和哺乳动物聚成一支.组织表达分析表明,TRIF在尼罗罗非鱼11个组织/器官中均有表达,在肌肉和血液中表达量最高.人工感染无乳链球菌可引起TRIF基因在脾脏和肾脏中的上调表达,均在感染后1 d达到最大值;LPS刺激后,TRIF在肝脏和脾脏中的表达呈上调趋势,在肠和肾脏中呈下调趋势;Poly I:C刺激后,TRIF在肠和肝脏中上调表达,在肾脏中下调表达.亚细胞定位和双荧光素酶报告分析显示,TRIF在293T细胞中定位于细胞质,可增强NF-κB活性.上述结果表明,TRIF基因在尼罗罗非鱼的免疫应答中可能具有重要作用,本研究可为进一步探讨硬骨鱼类TRIF基因在免疫进化中的功能提供参考依据.