转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

• 作者: 吴刚 张秀杰 李俊 李允静 李夏莹 武玉花 王颢潜 翟杉杉 陈子言 高鸿飞
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 转基因油菜 筛查 筛查策略 阳性质粒分子 应用
• 年，卷（期）: 2020,（7）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 1322-1337
• 页数: 16页
• 字数: 7482字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.003

摘要

[目的]转基因油莱是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑.转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分.建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑.[方法]通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标.通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列.一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列.人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子.采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性.[结果]建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP4-EPSPS、NPTⅡ、HPT、NOS终止子和PinⅡ终止子共9个基因元件,可实现已知信息转基因油菜品种的全覆盖.构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标基因HMG I/Y和CruA的转基因油菜筛查质粒分子pYCSC-1905.9个筛查元件和2个油菜内标基因的扩增效率均在90％-110％,证明质粒分子上的不同靶标序列没有相互干扰,影响PCR的扩增效率.质粒分子pYCSC-1905可用作9个筛查元件和2个油菜内标基因的通用阳性对照,适用于国家标准(GB/T和农业农村部公告)、出入境检验检疫行业标准(SN/T)和欧盟标准.[结论]提出的转基因油菜筛查策略涵盖9个基因元件,可实现从商业化到安全评价各阶段转基因油菜的筛查检测,显著降低转基因油菜的筛查漏检率.研制的配套质粒分子pYCSC-1905为转基因油菜筛查和各基因元件标准方法的应用提供了通用标准样品,保证检测机构间检测数据的准确性和可比性.