基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞转分化为肝干细胞的实验体系研究

• 作者: 虞欣璐 于兵 王辰 张红霞 朱海英
• 来源期刊: 癌变.畸变.突变
• 关键词: 四环素诱导型表达载体 转分化 小鼠胚胎成纤维细胞 诱导性肝干细胞 Hnf1β Foxa3
• 年，卷（期）: 2021,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 163-171
• 页数: 9页
• 分类号: R329.2+8
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-616x.2021.03.002

摘要

目的:建立基于四环素诱导型Hnf1β和Foxa3表达载体的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)转分化为肝干细胞(iHepSCs-Dox)的诱导实验体系,为后续转分化过程所涉及的分子机制研究提供有效工具.方法:构建TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry四环素诱导型慢病毒载体,经慢病毒介导将其转染入293FT细胞,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同浓度的多西环素(Dox)诱导外源基因表达水平的差异,确定最佳Dox诱导浓度;将两个诱导型表达载体转染到MEF细胞中,参照先前建立的诱导体系,在合适的Dox浓度下启动Hnf1β和Foxa3基因的表达,诱导MEF细胞的转分化.对经过20 d诱导出现的上皮样细胞集落进行扩增,获得iHepSCs-Dox细胞系.利用CCK-8法、克隆形成实验、碱性磷酸酶染色、体外诱导分化以及反转录PCR(RT-PCR)等实验,对所获得的iHepSCs-Dox细胞系的生物学特性作鉴定,同时与前期获得的诱导型肝干细胞系(iHepSCs)作对比,以此对基于四环素诱导型表达载体的转分化体系的诱导效果进行评价.结果:qPCR结果显示,在培养基中添加100 ng/mL的Dox作用24 h即可启动外源基因表达,撤去Dox 48 h后,外源基因的表达显著降低甚至关闭;RT-PCR结果显示,iHepSCs-Dox细胞表达胆管细胞的标志(CK19)、肝胆共同标志(CK18)以及肝脏干/前体细胞标志(Dlk1、Sox9、EpCAM),碱性磷酸酶染色结果显示阳性;具有形成克隆的能力;能够在体外诱导分化为肝干细胞,以上干性特征与前期构建的iHepSCs具有较大相似性.当从培养基中撤掉Dox之后,随着双因子表达的停止,iHepSCs-Dox细胞的增殖速率明显下降,CK18、EpCAM的表达下调;失去克隆形成能力,在体外无法诱导其分化为肝细胞.结论:成功建立了基于四环素诱导型双转录因子表达载体的MEF细胞转分化为肝干细胞的诱导体系,该诱导体系可以作为后续研究转分化过程中所涉及的分子机制的有效工具.另外,结果提示外源基因的持续表达是iHepSCs-Dox细胞干性维持的必要条件.