汉城病毒L99株双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立及应用

• 作者: 孙晨 唐剑光 孙宏亮 李景良 常军亮 顾建阳
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 关键词: 汉城病毒 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 抗原检测
• 年，卷（期）: 2022,（3）
• 所属期刊栏目: 检测技术
• 页码范围: 234-240
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn112309-20211207-00415

摘要

目的:建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，验证其检测性能，为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法:小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水，Protein-A亲和层析纯化腹水抗体，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度，间接ELISA法测定McAb效价，Western blot鉴定其特异性；叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后，通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度，建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准，验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度；通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果:4株McAb腹水效价均>1∶10 6，抗体纯度均>98%；经Western blot鉴定，1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白，2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应；经抗体配对筛选后，选择3A4为包被抗体，1D5为标记抗体；棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml，HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml；线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml， R2>0.99；专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性；抗原回收率在95.8%~108.7%之间，精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。 结论:成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中，SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。