人脂肪间充质干细胞来源外泌体对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞损伤的影响及其机制

• 作者: 蔡维霞 沈括 曹涛 王璟 赵明 王克甲 张月 韩军涛 胡大海 陶克
• 来源期刊: 中华烧伤与创面修复杂志
• 关键词: 脓毒症 急性肺损伤 活性氧 肺血管内皮细胞 8-羟基脱氧鸟苷
• 年，卷（期）: 2022,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 266-275
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211020-00362

摘要

目的:探讨人脂肪间充质干细胞（ADSC）来源外泌体对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞（PMVEC）损伤的影响及其机制。方法:采用实验研究方法。取空军军医大学第一附属医院收治的3例行腹部手术切除患者（均为女性，年龄10~25岁）遗弃的新鲜脂肪组织进行原代人ADSC的分离培养，于第5天采用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，采用流式细胞术检测ADSC中CD29、CD34、CD44、CD45、CD73和CD90的表达情况。选取第3~5代ADSC，采用差速超高速离心法获取其上清液中的外泌体，采用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法及蛋白质印迹法分别检测外泌体形状、粒径大小及CD9、CD63、肿瘤易感基因101（TSG101）和β肌动蛋白的蛋白表达。取24只成年雄性BALB/c小鼠，按照随机数字表法（分组方法下同）分成正常对照组、单纯盲肠结扎穿孔（CLP）组和CLP+ADSC外泌体组，每组8只，分别进行相应处理。术后24 h，采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）水平，采用苏木精-伊红染色和髓过氧化物酶染色检测小鼠肺组织形态，采用免疫荧光法检测小鼠肺组织细胞中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达。取1个月龄雌雄不拘C57小鼠，采用组织块法获取原代PMVEC。取第3代PMVEC，采用免疫荧光法和流式细胞术检测PMVEC中CD31的表达。取第3代PMVEC，与ADSC来源外泌体共培养12 h，采用PKH26试剂盒检测PMVEC吞噬外泌体的情况。取第3代PMVEC，将细胞分为空白对照组、单纯巨噬细胞上清液组和巨噬细胞上清液+ADSC外泌体组，每组3孔，分别进行相应处理。24 h后，采用流式细胞术检测细胞中活性氧含量，采用免疫荧光法检测细胞中8-OHdG表达，采用Transwell实验测定细胞单分子层通透性。以上样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD- t检验。 结果:分离的原代ADSC培养至第5天，呈梭形密集生长，呈典型的漩涡样排列。第3代ADSC中CD29、CD44、CD73和CD90阳性细胞百分比均>90%，CD34和CD45阳性细胞百分比均<5%。第3~5代ADSC来源外泌体呈典型的双凹盘状结构，外泌体平均粒径为103 nm，外泌体中CD9、CD63和TSG101的蛋白表达均呈阳性，β肌动蛋白的蛋白表达呈阴性。术后24 h，与正常对照组比较，单纯CLP组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均明显增加（ t值分别为28.76、29.69， P<0.01）；与单纯CLP组比较，CLP+ADSC外泌体组小鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量均明显降低（ t值分别为9.90、4.76， P<0.05或 P<0.01）。术后24 h，正常对照组小鼠肺组织结构清晰完整、无炎症细胞浸润，单纯CLP组小鼠的肺组织较正常对照组水肿明显、炎症细胞浸润现象明显，CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织较单纯CLP组水肿症状明显减轻、炎症细胞浸润明显减少。术后24 h，3组小鼠肺组织中CD31呈阳性表达；单纯CLP组小鼠肺组织中8-OHdG阳性细胞荧光强度较正常对照组显著增大，CLP+ADSC外泌体组小鼠肺组织中8-OHdG阳性细胞荧光强度较单纯CLP组明显下降。第3代PMVEC的免疫荧光结果显示CD31呈阳性表达，流式细胞术鉴定结果显示CD31阳性细胞占比为99.5%。共培养12 h，ADSC来源外泌体成功被PMVEC吞噬，进入胞质。第3代PMVEC培养24 h后，与空白对照组比较，单纯巨噬细胞上清液组PMVEC的活性氧荧光强度明显增加（ t=15.73， P<0.01）；与单纯巨噬细胞上清液组比较，巨噬细胞上清液+ADSC外泌体组PMVEC的活性氧荧光强度明显降低（ t=4.72， P<0.01）。第3代PMVEC培养24 h，与空白对照组相比，单纯巨噬细胞上清液组PMVEC的8-OHdG阳性荧光强度明显增强，巨噬细胞上清液+ADSC外泌体组PMVEC的8-OHdG阳性荧光强度介于空白对照组和单纯巨噬细胞上清液组之间。第3代PMVEC培养24 h，与空白对照组比较，单纯巨噬细胞上清液组的PMVEC单分子层细胞通透性明显增加（ t=6.34， P<0.01）；与单纯巨噬细胞上清液组比较，巨噬细胞上清+ADSC外泌体组的PMVEC单分子层细胞通透性明显降低（ t=2.93， P<0.05）。 结论:ADSC来源外泌体可改善小鼠肺组织氧化性损伤，降低由巨噬细胞上清液诱导的PMVEC的活性氧含量、8-OHdG表达以及细胞通透性。