摘要:

毛细管电泳(CE)被认为是核酸适配体筛选的高效方法,其无需介质固定,在溶液相中完成筛选,分离高效,样品用量少,筛选成本低.但由于小分子靶与核酸的结合位点少,且小分子的核酸复合物与核酸库的电泳迁移率差异小,通常认为CE-SELEX不适用于筛选小分子靶标的适配体.本研究建立了基于CE-SELEX的盐酸克伦特罗靶标的的适配体筛选方法.将80 nt的ssDNA库与盐酸克伦特罗特混合孵育,通过CZE-UV分离混合物.收集ssDNA库峰前的馏分,通过PCR扩增和ssDNA制备,完成第一轮筛选.将次级核酸库经过3轮筛选,获得10条ssDNA序列.选择3条亲和力较强的序列Apt 4、Apt 7、Apt 12,通过CE-LIF测定其与盐酸克伦特罗的Kd分别为9.315×10-7 mol/L、1.040×10-6 mol/L和1.143×10-5 mol/L.软件分析表明,上述3条序列均可形成茎环二级结构,其中Apt 4茎环结构的自由能最低,结构最稳定.以沙丁胺醇为对照,验证了3条序列,具有较高的特异性.

摘要:

毛细管电泳(CE)具有高分辨、快速分离、样品用量小和无需固相介质等优点,是高效筛选核酸适配体的方法之一.然而,由于CE的进样量少,有限的核酸库容量是否影响毛细管电泳-指数富集配体系统进化(CE-SELEX)适配体的筛选效率,尚不明确.本研究以神经元特异性烯醇化酶(NSE)为模式蛋白,考察了CE筛选中核酸库容量对筛选效率的影响,以明确CE-SELEX方法的有效性.分别使用4个浓度(0.1、1、10和100 μmol/L)的初始核酸库进行适配体筛选,比较了初始库与经3轮筛选后的次级核酸库的亲和力.结果 表明,4个核酸库筛选轮次间库亲和力相近,且经2轮筛选后均得到了微摩尔级别的核酸适配体.此外,用高浓度核酸库筛选获得的序列更具多样性,但未能提升候选序列亲和力.经2轮筛选得到NSE的核酸适配体Seq qN-01,其与NSE复合物的解离常数(KD)为(4.72±0.15)μmol/L,并表现出很好的特异性.综上,核酸库容量会提高后续富集库的序列多样性,但对适配体筛选效率没有显著影响.

摘要:

钙网蛋白(CRT)与许多癌症的发生密切相关,被认为是乳腺癌侵袭和转移的有效新型生物标志物以及乳腺癌分期和预后的评价指标.本研究利用毛细管电泳-指数富集配体进化技术(CE-SELEX)筛选并鉴定了CRT的核酸适配体.毛细管电泳法、等温滴定量热法及纳米金比色法表征结果表明,适配体Apt 23对CRT具有较高的亲和力和特异性.FAM标记的Apt 23(FAM-Apt 23)可用作毛细管电泳的亲和探针,采用激光诱导荧光检测器,检测血清中CRT的浓度范围为1～ 1000 nmol/L,检出限为0.5 nmol/L.FAM-Apt 23也可用作CRT的免疫荧光成像探针,可结合在CRT过表达的乳腺癌细胞4T1的表面.初步研究结果表明,利用毛细管电泳筛选的核酸适配体Apt 23可用于CRT识别和检测的探针.

摘要:

基于毛细管电泳-指数富集配体系统进化技术(CE-SELEX)建立了免疫球蛋白G(IgG)的Fc片段的核酸适配体筛选方法.通过毛细管区带电泳方法分析IgG完整蛋白、Fc与Fab片段的样品的纯度、荷电性质及是否吸附的特征,并比较三者与核酸库的亲和力.结果 表明,IgG与核酸库形成明显的复合物,而Fc和Fab片段与核酸库的亲和力很弱.在筛选Fc片段的适配体时,选择Fab片段作为反筛靶,对去除非特异性结合序列无显著作用.设计了针对Fc片段的适配体筛选方案,在优化的孵育条件(10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4(pH 7.17),0.05 mmol/L Mg2+,37℃孵育25 min)下,经3轮筛选获得Fc片段的核酸适配体Seq Fc1～3,KD值为0.071 ～0.321 μmol/L,经胶体金比色分析方法验证了其亲和力与特异性.