摘要:

目的 联合导向激光捕获显微切割技术(NLCM)及蛋白质组学技术比较分析高分化贲门腺癌细胞和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱差异,寻找与贲门腺癌恶性程度和预后有关的分子标志物.方法 应用导向激光捕获显微切割技术分别获取高分化和低分化贲门腺癌细胞,提取蛋白质,应用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离蛋白质,选定差异点,胶内酶解后,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDL-TOF MS)鉴定差异蛋白质,并用免疫组化方法验证差异蛋白的表达.结果 ①NLCM分别分离纯化了高分化和低分化贲门腺癌细胞;②建立了高分化和低分化贲门腺癌细胞的蛋白质表达图谱,两组分别检测到(846±52)个和(923±84)个蛋白质点,两组的匹配率为85.4％;③对高分化和低分化的贲门腺癌蛋白质表达谱进行比较分析,鉴定出10种差异蛋白,其中6个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达上调,4个蛋白质在低分化贲门腺癌细胞中表达下调;④差异蛋白质涉及细胞间信号转导、细胞代谢、凋亡及迁移等;⑤进一步通过免疫组化方法验证了差异蛋白HSP27的表达与蛋白质组学研究结果一致.结论 高分化和低分化贲门腺癌间存在蛋白质表达的差异,这些差异表达的蛋白质可能与贲门腺癌的恶性程度和预后有关.

摘要:

目的 建立一套适用于贲门腺癌差异蛋白质组学研究的导向激光捕获显微切割技术(navigated laser capture microdissection,NLCM)方法,并探讨其可行性.方法 比较染色剂和固定剂对蛋白质影响的差异,探讨不同处理条件下贲门腺癌和癌旁组织切片的镜下组织学特点,改进常规LCM,建立在染色切片指引下分离细胞的NLCM技术,并通过双向凝胶电泳分析对该技术进行评价.结果 染色剂对蛋白质的影响大于700 mL/L乙醇固定剂;光镜下在不染色的组织切片上,贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状上皮细胞都有其各自的形态特异性,易于辨认;NLCM可以准确纯化贲门腺癌细胞、肠化生细胞和正常柱状细胞;LCM的苏木素染色贲门腺癌细胞(A组)、NLCM的无染色贲门腺癌细胞(B组)和未切割的新鲜贲门腺癌组织(C组)的双向电泳表达图谱非常相似.各组蛋白质点的数量之间差异无统计学意义(P＞0.05).A组碱性端蛋白等点聚焦较差,部分蛋白质点的表达量减低或消失,B组双向电泳表达图谱蛋白质点分离较好.结论 NLCM不但可以快速、准确地将贲门腺癌及其癌前病变细胞进行分离,而且有效避免了染色剂对蛋白质提取质量的影响,是一项适用于贲门腺癌蛋白质组学研究的样品制备方法.

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目的探讨激光捕获显微切割分离大鼠脑微血管和神经元联合功能分类表达谱cDNA芯片技术在脑缺血研究的应用.方法激光捕获显微切割获取脑切片微血管和神经元,微量RNA提取试剂盒提取总RNA,线性扩增mRNA,紫外分光光度计定量所得aRNA(antisense RNA)扩增效率,基因特异性引物进行cDNA探针合成,进行芯片杂交反应.结果微血管和神经元各自捕获的总点数大约为8000～10000,T7线性扩增所得aRNA的量约为500～1000ng,探针合成效率高,杂交反应格局清晰良好.结论激光捕获显微切割,结合T7 RNA线性扩增及基因特异性引物线性扩增技术,可成功的应用于功能分类表达谱cDNA芯片的分析研究.

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目的 探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性.方法 将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8 μm冰冻切片,采用改良的HE方法染色;应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞;选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞.结果 通过LCM技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织,得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞.按照Duration 15.5 s的激光脉冲频率和平均8 000 shots条件,既可保证每个帽子的细胞收集数量,也能够有效地缩短实验时间,提高实验可控性,从而使操作过程标准化.结论 应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞.其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好,是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法.

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目的 探讨人细小病毒B19感染与结直肠癌发生的关系.方法 运用原位杂交对50例石蜡包埋结直肠癌患者的肿瘤组织,癌周结直肠组织以及10例正常成人结肠组织中B19病毒进行检测.激光捕获显微切割肿瘤细胞及癌周正常肠上皮细胞,巢式PCR扩增B19 DNA.结果 50例结直肠癌标本中,原位杂交示B19阳性信号在肿瘤组织为78%(39/50),癌周结直肠组织为40%(20/50),正常结肠组织中5例(n=10),经统计分析肿瘤与癌周组织B19感染差异有显著性(P<0.01),正常结肠组织与癌周组织间未见统计学差异(P=1.000).显微切割进一步证实B19病毒DNA存在于肿瘤细胞内.结论 结直肠组织中人细小病毒B19感染较常见,主要存在于结直肠癌上皮细胞内,该病毒可能在结直肠癌的发生过程中起一定作用.

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目的:探讨卵巢癌组织中EphA2受体蛋白的表达及其评价预后的价值.方法:应用免疫组织化学法对135例卵巢癌组织进行EphA2检测,对其中15例不同级别EphA2蛋白表达的冰冻组织标本,应用激光捕获显微切割技术(LCM)捕获卵巢癌细胞,应用Western印迹分析方法检测其蛋白表达水平.结果:在135例卵巢癌组织中,EphA2蛋白阳性表达率为91.1%,分别为(-)12例(8.9%),(+)75例(55.6%),(++)30例(22.2%),(卅)18例(13.3%).EphA2蛋白表达与卵巢癌患者的年龄、FIGO分期、组织学类型、组织分化程度以及残余肿瘤大小均无关(P＞0.05).平均生存时间在EphA2蛋白染色强度-～+组与++～卅组间差异有统计学意义(P＜0.05),且Western印迹结果与免疫组织化学结果一致.结论:EphA2蛋白高表达与卵巢癌患者生存差有关,具有潜在的预测预后价值.

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目的 建立单细胞cDNA扩增技术,实现在分子水平鉴定循环肿瘤细胞.方法 建立结肠癌循环肿瘤细胞模型,通过免疫荧光染色和显微切割技术分离出单个血细胞和肿瘤细胞;裂解细胞后利用碱基修饰的P1(dT)24引物反转录出cDNA第一链,并给第一链cDNA加上PolyA尾后利用碱基修饰的P2(dT)24引物合成第二链cDNA,然后利用P1(dT)24和P2(dT)24引物扩增分别得到血细胞和肿瘤细胞的全长cDNA;最后通过PCR检测细胞特异的标记物CD45、EpCAM和CK19.结果 改良后的单细胞cDNA扩增方法能够获得高质量的全长cDNA,并能显著增加PCR检测效率;利用扩增得到的cDNA通过PCR检测细胞表面标记物CD45、EpCAM和CK19的表达,能有效鉴定出外周血中混杂的肿瘤细胞.结论 通过单细胞cDNA扩增技术在基因水平识别肿瘤细胞,建立了一种新的循环肿瘤细胞的鉴定方法.

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目的 探讨IHC双标记技术结合LCM技术在研究HL肿瘤细胞与背景细胞中的应用.方法 选取10例HI标本,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋组织,采用不同的抗原修复方法 ,通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞.结果 在10例HL标本中通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞,二者表现出不同的颜色以及表达不同的CD分子.结论 通过IHC双标记与LCM技术获得单一的肿瘤细胞和背景细胞,IHC双标记在HL研究中起着区分不同细胞的作用.

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目的比较分析胃癌与正常胃黏膜组织间差异，筛选与纯化出胃癌相关蛋白质。方法应用冰冻切片、苏木素-伊红染色、甲基绿染色、激光捕获显微切割( LCM)技术，获取高纯度的胃癌组织与正常胃黏膜的腺体组织，提取LCM纯化后组织细胞总蛋白，测定总蛋白浓度。结果快速制作出正常胃黏膜上皮和胃腺癌组织快速冰冻切片和HE病理切片，高纯度纯化胃腺癌细胞(GAC)和正常胃黏膜上皮细胞(NGEC)，得出蛋白定量标准曲线与直线回归方程。结论运用LCM可高纯度筛选胃腺癌差异表达蛋白质，此结果为寻找胃癌早期诊断及治疗的蛋白质分子标志物提供前期基础。

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目的 探讨应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)技术获取高同质性肺癌组织细胞及正常对照肺泡上皮细胞的方法及可行性.方法 将新鲜肺癌组织标本及其配对正常组织常规制备8 μm冰冻切片,采用改良的HE方法染色;应用LCM技术大宗切割肺鳞癌、腺癌及正常对照肺泡上皮细胞;选择性获取同质肺癌细胞和配对正常细胞.结果 通过LCM技术可以准确、快速地分离癌细胞、间质及其他坏死组织,得到同质性不低于95%的肿瘤细胞和正常细胞.按照Duration 15.5 s的激光脉冲频率和平均8 000 shots条件,既可保证每个帽子的细胞收集数量,也能够有效地缩短实验时间,提高实验可控性,从而使操作过程标准化.结论 应用LCM技术可以成功获取同质肺癌细胞和正常细胞.其所需标本量少、组织同质性高、操作过程稳定、可控性好,是肺癌分子生物学及蛋白质组学研究有价值的样品制备方法.