摘要:

目的 构建转基因番茄Zeneca B,Da,F品系的质粒标准分子及其实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系.方法 基于反向遗传学原理构建分别含有番茄内标准基因apx检测序列(ERG-apx),转基因番茄B,Da,F品系pg基因的基因特异性序列(GS-pg)及其构建特异性序列(CS-16S、CS-16A)的番茄内参质粒标准分子pEasy-T3-APX,转基因番茄B,Da,F品系的构建特异性质粒标准分子pEasy-T3-16A、pEasy-T3-16S;以Beacon Designer7.5设计用于定性PCR和qPCR检测的引物对和Taqman探针;基于质粒标准分子建立了定性PCR和qPCR检测体系,对方法的特异性、敏感性、重复性、检测下限等指标进行评估;使用PicoGreen试剂盒对质粒标准分子进行定量,以质粒pEasy-T3-APX为背景DNA定量混有pEasy-T3-16A或pEasy-T3-16S制备成含量为1%和0.1%(w/w)的两组核酸标准物质,进行所构建qPCR检测体系的定量性能评价.结果 锚定qpCR检测靶序列:ERG-apx 108bp,GS-pg 108bp,CS-16S 109bp、CS-16A 102bp;酶切鉴定所构建的质粒标准分子均可得到预期大小,的插入子片段;所建立的实时荧光定量PCR(qPCR)检测体系,重复性的相对标准差(RSD)0.2%～1.5%,检测下限25 copies,标准曲线方程线性关系R2值在0.994～0.998,效率在93.3%～102.4%.经换算系数Cf换算,对PicoGreen定量的样品进行验证,其实测值与真值的偏差是-9.7%～17.3%.结论 成功构建了转基因番茄ZenecaB,Da,F品系的质粒标准分子及其qPCR检测体系,为转基因番茄Zeneca B,Da,F品系转基因成分的监测建立了可行的可供使用的定性与定量检测体系.

摘要:

以A2704-12、A5547-127、MON89788和GTS-40-3-2等4种商品化耐除草剂转基因大豆为材料,构建质粒标准分子用于解决转基因作物检测时标准物质缺乏现状.采用双酶切技术,将扩增的大豆内参基因和耐除草剂转基因大豆转化体特异性片段克隆至pMD18-T载体上.结果显示,质粒标准分子定性PCR特异性序列片段的LOD均为20 copies/μL,定量检测体系Bias最大值≤9.89％,CV最大值≤5.96％,SD最大值≤0.06,实验得到的所有偏差值均在允许范围之内,构建的质粒标准分子适用于4种耐除草剂转基因大豆特异性检测.

摘要:

质粒标准分子是指含有外源基因和内源标准基因特异性片段的重组质粒分子.为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状,本研究通过分析转基因作物的分子特征,选取启动子花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S)、农杆菌Ti质粒胭脂碱合酶基因的终止子(NOS)、新霉素磷酸转移酶标记基因(NPTⅡ)、水稻蔗糖磷酸合酶内标基因(SPS)、棉花纤维特异的酰基载体蛋白内标基因(fsACP)及编码苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CrylAb的抗虫基因(crylAb)作为靶标序列,并克隆到pEASY-T3载体上,构建包含6个基因元件的质粒标准分子.经PCR鉴定、酶切、测序等验证标准分子构建的正确性,对其重复性、均匀性、均一性、稳定性及定量方法进行系统研究.结果表明,针对质粒的3种定量方法中,数字PCR的准确度最高,PicoGreen法次之,紫外分光光度法的精确度较差;所建质粒的均匀性、重复性、稳定性均十分良好,合成不确定度均在2.81％以下,符合标准物质候选物的要求;所建质粒可在低温条件下保存1个月以上,不宜高温(大于20℃)保存或运输.本研究所建标准分子可用于检测含crylAb、35S、NOS和NPTⅡ的转基因材料,亦可用于定量转基因水稻及转基因棉花的转基因成分含量.本研究的质粒构建、制备和正确性验证方法可为转基因检测用质粒标准分子的研制提供参照;重复性、均匀性、均一性、稳定性及定量方法等的分析结果可为质粒标准分子的性状分析、保存环境等的相关研究或申报国家标准物质提供实验依据.

摘要:

[目的]构建适用于转基因大豆MON89788检测的质粒标准分子.[方法]利用定性PCR和连接、转化等分子克隆技术,将大豆内标准基因lectin、MON89788的3′端特异性序列和5′端特异性序列依次克隆到pMD18-T载体上,获得质粒标准分子pMD-LM3M5,并进行适用性验证.[结果]获得了3 700 bp的质粒标准分子,其中重组DNA片段1 029 bp.该质粒标准分子的定性PCR检测灵敏度达到10 copy.[结论]该研究构建的质粒标准分子pMD-LM3M5能替代MON89788基体标准品,用于MON89788大豆及其产品的定性PCR检测.