摘要:

目的 探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响.方法 选取食管鳞癌细胞株Eca9706,并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株.MTT法检测干预前后细胞增长率的变化,FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化,RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达,免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达.结果 食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后,超甲基化状态解除,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率明显提高(P＜0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强,同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P＜0.05).结论 食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达,当其超甲基化解除后,细胞增殖受到抑制,同时细胞凋亡率相应提高.

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为探究脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) 甲基化修饰对丝状真菌里氏木霉 (Trichoderma reesei,T.reesei) 产纤维素酶基因表达的表观遗传调控机制,利用不同浓度(0~1.0 mmol/L)的化学修饰剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine, 5′-Aza)培养T.reesei QM9414.通过测定滤纸酶活性(filter paper enzymatic activities,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(carboxymethyl cellulose-Na enzymatic activities, CMCA)确定纤维素酶活性的变化;利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测0.1 mmol/L 5′-Aza培养的T.reesei QM9414中纤维素酶基因cbh1、 egl1、 酶激活因子xyr1基因以及分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的表达水平;通过甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MS-PCR)分析cre1、 ace1、 cbh1、 egl1和xyr1基因上游序列的甲基化状态;利用Western blot和DNA甲基化定量测定分析了DNA甲基转移酶和DNA的甲基化水平.结果显示,0.1 mmol/L 5′-Aza处理后的T.reesei QM9414菌株的FPA和CMCA最高,比出发菌株T.reesei QM9414分别高30%和53%;RT-qPCR结果显示,处理后的T.reesei QM9414菌株中纤维素酶基因cbh1、 egl1与酶激活因子xyr1基因的相对表达量均高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1和ace1基因的相对表达量与出发菌株无明显差异;MS-PCR结果显示, cbh1、 egl1和xyr1基因的非甲基化状态高于出发菌株,而分解代谢阻遏因子cre1与ace1基因的非甲基化状态也无明显差异;Western blot和DNA甲基化定量测定结果分别显示,5′-Aza处理后菌株的DNA甲基转移酶表达比出发菌株明显降低,全基因组DNA甲基化程度也有下降.研究结果表明,5′-Aza处理T.reesei QM9414菌株后,纤维素酶活性明显增加,纤维素酶基因cbh1、 egl1和激活因子xyr1基因表达水平的增加可能是通过DNA甲基转移酶影响DNA甲基化水平,最终调控基因的表达.

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目的 研究5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-dC)及曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对人胃癌细胞系SGC-7901细胞增殖、凋亡及移植瘤生长的影响,从体内、体外观察抑癌基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达,核转录因子NF-κB活性的改变,探讨5-Aza-dC联合 TSA用于胃癌临床治疗的可行性.方法 实验分对照组、5-Aza-dC组、TSA组和5-Aza-dC联合TSA组,利用CCK-8增殖试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞术分析细胞凋亡,RT-PCR检测各组MGMT mRNA表达,Western blot检测MGMT、NF-κB p65蛋白表达及NF-κB p65的磷酸化水平.结果 5-Aza-dC、TSA单独处理均可抑制SGC-7901细胞的生长和促进其凋亡,联合用药后效果更明显(P<0.05);与对照组相比,单药组移植瘤变化没有统计学意义(P>0.05),而联合用药组较单药组移植瘤变小;5-Aza-dC、TSA单独或联合处理SGC-7901细胞和裸鼠移植瘤后,与对照组比较,MGMT基因mRNA及蛋白表达水平均上调,联合用药比单独用药升高明显,NF-κB p65在各处理组中的表达量未发生变化,但其磷酸化程度较对照组下降,联合用药较单药下降更明显(P<0.05).结论 5-Aza-dC与TSA发挥抑制胃癌生长的作用可能是通过抑制NF-κB的活性,提高MGMT基因的转录和表达而实现的,两药联合使用的抗癌效果更加明显.

摘要:

目的 观察5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的胃癌BGC823细胞增生和凋亡的影响及其对此细胞中DAPK1基因的甲基化状态的影响.方法 选择浓度为1×10-6的5-Aza-CdR处理体外培养的BGC823细胞后,用Annexin-v-FITC凋亡检测药物处理后细胞凋亡情况;MSP法检测用药前后细胞中Apaf-1基因的甲基化状态;RT-PCR法检测用药前后细胞中DAPK1的mRNA表达的变化.结果 在药物作用24、48、72 h后细胞的凋亡率分别为5.83±0.53、9.23±0.58、15.34±0.90,较对照组明显增加(P＜0.05).DAPK1基因的甲基化状态得到了逆转,DAPK-1基因的mRNA表达得到增加.结论 5-Aza-CdR对BGC823细胞具有增生抑制作用,并促进细胞凋亡.DAPK1基因表达情况与其甲基化状态的改变有关.

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目的 观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P16基因mRNA表达.MIT法观察细胞生长速度,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率.结果 P16基因在人结肠癌细胞系Caco-2中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,P16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达.CpC岛去甲基化后能明显地抑制细胞的生长,诱导细胞凋亡,影响细胞周期分布,并具有良好的量效依赖关系.结论 5-Aza-CdR能够逆转P16基因甲基化状态,调控P16基因表达并有效地抑制肠癌细胞增殖.

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目的 研究甲基化抑制物5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-AzaCdR)干预对胰腺癌细胞株PANC-1侵袭和迁移能力的影响,初步探讨其发挥作用的机制.方法 用不同浓度的5-AzaCdR处理PANC-1细胞株,采用划痕迁移试验和Transwell小室法观察干预前后细胞迁移和侵袭能力的改变,免疫荧光染色法检测干预前后细胞MMP-2的表达.结果 经5-Aza-CdR干预后,与对照组相比,PANC-1细胞的迁移和侵袭能力明显减弱(P＜0.05),细胞内MMP-2的表达降低(P＜0.05).结论 5-Aza-CdR可以明显抑制胰腺癌细胞株PANC-1的侵袭转移能力,其机制可能是通过抑制MMP-2的表达而降低肿瘤细胞的侵袭和转移.

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目的 探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响.方法 选取食管鳞癌细胞株Eca9706,并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株.MTT法检测干预前后细胞增长率的变化,FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化,RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达,免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达.结果 食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后,超甲基化状态解除,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率明显提高(P＜0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强,同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P＜0.05).结论 食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达,当其超甲基化解除后,细胞增殖受到抑制,同时细胞凋亡率相应提高.

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目的：探讨 p21Waf1／Cip1启动子甲基化改变对细胞衰老进程的影响。方法采用克隆、测序的方法定量检测p21Waf1／Cip1启动子在人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）衰老过程中的甲基化改变；RT‐PCR和Western blot检测p21Waf1／Cip1的表达；采用5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷去甲基化处理2BS细胞，通过M T T和β‐半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果 p21Waf1／Cip1启动子在年轻2BS中，CpG甲基化的发生率为1．25％；在中年细胞中为27．27％；在衰老2BS细胞中为0．64％；p21Waf1／Cip1的表达在细胞衰老过程中呈波动性变化，先增加，后降低，到细胞开始衰老时，表达又显著增加；中年2BS细胞经5‐氮杂‐2‐脱氧胞苷处理后，p21Waf1／Cip1表达增加，细胞增殖速率较正常中年细胞显著降低，同时细胞β‐半乳糖苷酶染色阳性率增加。结论 p21Waf1／Cip1去甲基化加速细胞衰老。