东方鲎C因子的分段克隆及表达

• 作者: 刘杰武 吴祥甫 张惟杰 杨冠珍 汪洌 王东宁 陈琳
• 来源期刊: 生物化学与生物物理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 东方鲎C因子 克隆 表达 抑菌
• 年，卷（期）: 2002,（1）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 77-82
• 页数: 6页
• 分类号: Q5
• 语种: 英文

摘要

东方鲎 C因子(factor C from Tachypleus tridentatus)是鲎血细胞中的一种对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原, 它与内毒素特异结合的特性, 使之具有很大的应用价值. 根据报道的 C因子序列, 设计了两对引物, 以中国福建沿海的东方鲎(Tachypleus tridentatu s) 为材料抽提其血细胞总RNA, 首次用RT-PCR的方法分两段扩增了鲎血中编码C因子蛋白的基因全序列. 序列分析表明, 得到的FC基因与文献报道的来自日本的东方鲎的FC有很高的同源性. 将分段克隆得到的两段FC片段经相应酶切后, 与含T7启动子的质粒pET-28a (+)在一个体系中作连接反应, 构建表达质粒pET28a-FC, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株. 表达菌株经1 mmol/L IPTG诱导表达2.5 h后, 收集菌体并超声破菌. 经SDS-PAGE 分析表明, 在110 kD左右处有明显的表达条带, 大小与FC的计算分子量相吻合. 但表达产物以包涵体形式存在. 经洗涤与变复性后, 重组FC在体外表现出明显的抑菌活性. 同时蛋白质印迹实验也提示了在大肠杆菌中FC的单基因表达物可能发生部分自剪切反应, 而形成了额外的免疫印迹条带.