抑制性消减杂交技术筛选NS5ATP13 蛋白的上调基因

• 作者: 党晓燕 张黎颖 成军 王建军 王春花 纪冬 邓红
• 来源期刊: 胃肠病学和肝病学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 丙型肝炎病毒NS5A蛋白 反式激活 消减杂交
• 年，卷（期）: 2004,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 39-42
• 页数: 4页
• 分类号: R512.63
• 字数: 3365字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2004.01.011

摘要

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5ATP13蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV NS5ATP13蛋白反式激活靶基因.方法以HCV NS5ATP13表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATPl3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析.结果成功构建人HCV NS5ATPl3蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到102个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中96个均得到100～1 000bp插入片段.挑取40个插入片段测序分析,其中2个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录,另有34个为已知功能序列.结论成功筛选出2个新的cDNA序列,并获得其全长序列,可能为HCV NS5ATP13蛋白反式激活相关靶基因.