应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活的相关基因

• 作者: 党晓燕 刘妍 成军 杨倩 王建军 王春花 纪冬 董菁 郭江
• 来源期刊: 胃肠病学和肝病学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙型肝炎病毒 前-S1蛋白 反式激活
• 年，卷（期）: 2004,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 3-8
• 页数: 6页
• 分类号: R512.62
• 字数: 5979字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-5709.2004.01.002

摘要

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆前-S1反式激活相关基因,以期发现前-S1蛋白反式激活作用的靶位点,为阐明前-S1蛋白的反式激活作用的分子生物学机制,以及HBV相关肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌DH5α进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到67个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到51个200～1 000 bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得32种编码基因,其中26个为已知功能基因,另外6个为未知功能序列,可能是前-S1蛋白反式激活新的靶基因.结论成功构建HBV前-S1反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.为进一步阐明前-S1蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.