应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因

• 作者: 党晓燕 吴煜 张黎颖 成军 杨艳杰 王春花 郎振为
• 来源期刊: 世界华人消化杂志
• 学科: 医学
• 年，卷（期）: 2004,（7）
• 所属期刊栏目: 病毒性肝炎
• 页码范围: 1564-1568
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 5988字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-3079.2004.07.013

摘要

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNAP)末端蛋白反式激活基因.方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到38个白色克隆,经菌落PCR分析,得到36个200-1 000bp插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列,可能是RNase H反式激活靶基因.结论:成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.