多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的原核表达、纯化及酶活检测

• 作者: 史宁 吴士良 周迎会 杭赛宇 贾伟
• 来源期刊: 江苏大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2 原核表达 GST融合蛋白 谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析 酶活检测
• 年，卷（期）: 2006,（2）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 93-96
• 页数: 4页
• 分类号: Q53|R34
• 字数: 2671字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-7783.2006.02.001

摘要

目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E. Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测.方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2.重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白.对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化.然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析.结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经Western印迹得以验证.反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰.结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	吴士良	苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室	95	458	11.0	17.0
2	周迎会	苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室	32	200	7.0	13.0
3	杭赛宇	苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室	6	16	2.0	4.0
4	史宁	苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室	7	35	3.0	5.0
5	贾伟	苏州大学医学院生物化学与分子生物学教研室	5	11	1.0	3.0