Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

• 作者: 吴军 周丽娜 张小容 柏甘萍 王庆红 石东文 罗高兴 胡晓红 袁顺宗 贺伟峰 陈希炜
• 来源期刊: 第三军医大学学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 基因 克隆 Foxp3 酵母双杂交
• 年，卷（期）: 2006,（8）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 781-784
• 页数: 4页
• 分类号: Q503|Q782
• 字数: 4343字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-5404.2006.08.013

摘要

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.