重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响

• 作者: 冯文莉 曾建明 涂植光 温健萍 王小中 白卫君 罗云萍 赵世巧 黄宗干
• 来源期刊: 第三军医大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: 慢性粒细胞白血病 PKR 反义RNA 逆转录病毒载体 基因克隆
• 年，卷（期）: 2006,（21）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 2130-2134
• 页数: 5页
• 分类号: Q782|R329.28|R733.722
• 字数: 4077字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-5404.2006.21.006

摘要

目的 构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响.方法 以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Western blot检测PKR激活情况.结果 酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24 h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.结论 成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略.