弓形虫腺苷激酶基因的克隆、表达及多抗血清的制备

• 作者: 乔增培 余莉 李霞 沈继龙 罗庆礼
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 学科: 医学
• 关键词: 弓形虫 腺苷激酶 基因 克隆 表达 多抗血清
• 年，卷（期）: 2008,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 495-499
• 页数: 5页
• 分类号: R531.8
• 字数: 3929字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2008.06.003

摘要

目的 克隆弓形虫RH株腺苷激酶(AK)基因,构建原核表达载体pET28a/AK,表达AK重组蛋白,利用此重组蛋白免疫新西兰白兔制备多抗血清.方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA.设计合成的引物并引入BamHI和XhoI酶切位点,应用RT-PCR扩增弓形虫AK基因片段,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,BamHI和XhoI双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a中,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌E. Coli BL21 (DE3)并以IPTG诱导表达.亲和层析法纯化重组蛋白抗原,SDS-PAGE和Western blotting验证表达量和免疫活性,免疫新西兰白兔,收集多抗血清,ELISA测定多抗滴度,Western blotting鉴定免疫活性.结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出1092bp的AK目标基因片段,并构建原核表达载体,诱导含pET28a/AK的宿主菌获得了高浓度、与预期分子量大小相符的表达产物,经Ni2+亲和层析法纯化获得了高纯度的rAK蛋白,Western blotting显示rAK能够被TORCH试剂盒中的Tox-IgG阳性控制血清识别,获得了纯化的重组蛋白.rAK蛋白免疫新西兰白兔,获得滴度为1:106多价抗血清.结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了AK基因,构建了pET28a/AK重组质粒,并获得了高效表达,免疫新西兰白兔获得了高效价多克隆抗体,为弓形虫iRNA及弓形虫病的免疫诊断奠定了基础.