奶牛隐孢子虫Nested PCR-RFLP方法的建立及初步应用

• 作者: 安立刚 朱志宏 李安平 王权 蒋蔚 袁耀明 陈永军
• 来源期刊: 中国动物传染病学报
• 学科: 农学
• 关键词: 奶牛 隐孢子虫 巢式PCR-RFLP
• 年，卷（期）: 2009,（3）
• 所属期刊栏目: 寄生虫
• 页码范围: 65-72
• 页数: 8页
• 分类号: S858.232.723
• 字数: 4794字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-6422.2009.03.012

摘要

为快速检测并准确鉴别奶牛隐孢子虫种,以隐孢子虫18SrRNA基因的特殊区域为基础,设计内、外引物,并根据软件分析确定相应的内切酶EcoT14I,采用Nested PCR-RFLP方法进行虫种种型鉴别分析.在NestedPCR两次PCR反应中,以微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.p)和安氏隐孢子虫(Cryptosporidiumandersoni,C.an)卵囊提取的DNA为模板,均能扩增出长约800 bp和500 bp的明亮条带,且特异性强,其他虫种不能扩增出条带,该方法最低可检测到5个卵囊/g粪便;对于由内引物扩增出的500 bp的条带,C.an的PCR产物能被内切酶EcoT141酶切,酶切后的片段分别为416 bp和92 bp,C.p的PCR产物不能被此酶酶切.用所建立的Nested PCR-RFLP法对上海奶牛389头和进口奶牛200头的共计589份粪样进行检测,Nested PCR的结果表明上海奶牛和进口奶牛的隐孢子虫阳性率分别为19.02%和3.5%,RFLP的结果表明上海奶牛感染的主要是C.p和C.an,进口奶牛感染的主要是C.p.研究结果表明,本研究建立的检测奶牛粪便中的隐孢子虫的Nested PCR-RFLP法,可用于奶牛隐孢子虫流行病学调查并有效鉴别奶牛隐孢子虫种.