内含肽介导F309SfⅧ的连接和重链分泌的增强

• 作者: 刘泽隆 屈慧鸽 朱甫祥 迟晓艳
• 来源期刊: 生理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 凝血因子Ⅷ 分泌 内含肽 蛋白质反式剪接
• 年，卷（期）: 2009,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 526-532
• 页数: 7页
• 分类号: Q5|Q78
• 语种: 中文

摘要

凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ,fⅧ)是一种分泌性血浆蛋白,在凝血级联反应中发挥重要作用,由fⅧ缺陷导致的甲型血友病是一种最常见的X-联锁隐性遗传性出血性疾病,基因治疗被认为是该病的理想治疗模式,但在运用最有希望的腺辅助病毒(adeno-associated virus,AAV)载体转fⅧ基因时受到AAV的容量限制.本文旨在利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接,研究双载体真核细胞转具有促分泌作用的F309S突变体全长fⅧ(F309SfⅧ)基因.内含肽是一种包埋在蛋白质前体中的多肽序列,其在蛋白质成熟过程中通过蛋白质剪接作用被切除.将F309SfⅧ的cDNA于B结构域的Ser~(12390)密码子前断裂为重链(heavy chain,HC)和轻链(light chain,LC)两部分,分别与Ssp DnaB intein编码序列融合,插入到pcDNA3.1,构建一对质粒表达载体.共转染或分别单独转染293细胞,48 h后用Western blot观察细胞内转基因的表达和F309SfⅧ的剪接,用ELISA检测培养上清中分泌的F309SfⅧ蛋白量以及HC含量,用Coatest法检测培养上清的fⅧ生物活性.结果显示,共转染细胞有明显的完整F309SfⅧ蛋白条带形成,细胞培养上清中的F309SfⅧ蛋白浓度为(71±9)ng/mL,所产生的fⅧ生物活性为(0.38±0.09)IU/mL,从单独转染后合并培养的细胞上清仍可检测到F309SfⅧ蛋白和fⅧ生物活性,分别为(25±6)ng/mL和(0.12±0.05)IU/mL,说明上清中的F309SfⅧ蛋白由分泌前、后剪接两部分共同形成.共转染细胞培养液上清中的HC含量明显高于单独转染融合内含肽和HC的细胞培养液上清[(135±10)ng/mL vs(37±7)ng/mL,P<0.01)].以上结果提示内含肽可作为一种技术手段用于双载体系统真核细胞F309SfⅧ基因转移,并可改善F309SfⅧ的分泌,为体内甲型血友病基因治疗研究中应用AAV载体、克服其容量限制转F309SfⅧ基因提供了一种解决方案.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	屈慧鸽		72	330	10.0	15.0
2	刘泽隆		49	99	7.0	9.0
3	朱甫祥		38	21	3.0	4.0
4	迟晓艳		47	54	4.0	6.0