血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

• 作者: 党时鹏 张学光 张燕 李肖蓉 杨丽华 王如兴 王明元 陈永井
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 血红素加氧酶1 克隆 表达载体 构建
• 年，卷（期）: 2009,（7）
• 所属期刊栏目: 组织构建与生活性因子
• 页码范围: 1255-1258
• 页数: 4页
• 分类号: R394.33
• 字数: 4331字
• 语种: 中文

摘要

背景:近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点.目的:克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体.设计、时间及地点:实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成.材料:成年雄件SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMDl8-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存.方法:分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录一聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMDl8.T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证.测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体.主要观察指标:血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2.EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体.结果;①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致.②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中.结论:实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体.