人E2F2基因重组腺病毒的构建及在293细胞中的表达

• 作者: 余力生 杨仕明 王琳 郭维维
• 来源期刊: 中华耳科学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: E2F2基因 重组腺病毒载体 基因治疗
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 页码范围: 461-465
• 分类号: R349.6
• 字数: 3877字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-2922.2010.04.022

摘要

目的 构建含有人E2F2基因和绿色荧光蛋白基因(pEGFP)的腺病毒载体,为聋病的基因治疗奠定实验基础.方法 根据已知的E2F2基因序列设计并合成相应的双链DNA,将其与酶切线性化的pDC315-EGFP载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2,并将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒.对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定.用聚合酶链反应和测序方法 验证穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2穿梭质粒的构建;通过荧光显微镜和Western blot(蛋白质印迹)方法,分别检测质粒pDC315-GFP-E2F2和重组腺病毒表达E2F2蛋白情况.结果 经聚合酶链反应鉴定和测序分析.证实穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2与设计一致;经荧光显微镜检测,分别由穿梭质粒pDC315-GFP-E2F2、重组腺病毒转染的HEK293细胞均可观察到GFP表达;经Western Blot检测出在72 kDa～95 kDa处有条特征带,其大小和E2F2-GFP融合蛋白(～76 kDa)相吻合;滴度测定为1×1011 PFU/ml(PFU,plaque forming unit,空斑形成单位).结论 成功构建了人E2F2基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	余力生	北京大学人民医院耳鼻咽喉科	144	1777	23.0	36.0
2	郭维维	解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科	27	103	6.0	8.0
3	杨仕明	解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科	143	712	12.0	20.0
4	王琳	解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科	54	341	10.0	17.0