蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

• 作者: 梁俊波 王琳芳 程筱雯 缪时英
• 来源期刊: 中国医学科学院学报
• 关键词: 蛋白激酶Nemo样激酶 重组腺病毒载体 同源重组
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 632-637
• 分类号: Q-31
• 语种: 中文
• DOI: 10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.010

摘要

目的 构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体.方法 采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增.通过Pacl酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装.包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT 116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达.结果 经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT 116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白.结论 成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	缪时英	中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室	15	26	3.0	4.0
2	王琳芳	中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室	13	9	2.0	2.0
3	程筱雯	中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室	1	0	0.0	0.0
4	梁俊波	中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室	3	1	1.0	1.0