牛Oct4基因克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

• 作者: 吕长荣 窦忠英 辛晓玲 陈冬梅
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: Oct4基因 克隆 逆转录病毒载体pMSCV 牛
• 年，卷（期）: 2010,（3）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 526-532
• 分类号: S8
• 字数: 6374字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2010.03.018

摘要

为了克隆奶牛Oct4基因开放性阅读框全序列,并建立高效、稳定产生逆转录病毒质粒pMSCV-Oct4的包装细胞株.我们以50～60日龄的胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR的方法扩增出牛Oct4基因全序列,全长为1 083 bp与GenBank公布的序列的同源性为99.4%.将其插入到逆转录病毒载体pMSCVneo的多克隆位点,获得重组逆转录病毒质粒pMSCVneo-Oct4.鉴定正确后,通过Lipofectamine2000将其转导入包装细胞PT67,用含有G418的培养液进行抗性筛选,获得阳性细胞克隆.细胞上清经过RT-PCR、透射电镜及病毒滴度测定等方法鉴定,证实所包装病毒存在,其滴度值为8.83×107 cfu/mL.试验结果表明我们已获得携带牛Oct4基因的高滴度感染性逆转录病毒.