Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定

• 作者: 史智扬 吴涛 张晓 曾晓燕 焦永军 詹峰 郭喜玲 金秋 陈银
• 来源期刊: 医学分子生物学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: Ⅱ型志贺毒素 单克隆抗体 单链抗体 表达 功能鉴定
• 年，卷（期）: 2010,（5）
• 页码范围: 382-387
• 分类号: R392.11
• 字数: 3165字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-8009.2010.05.002

摘要

目的 从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因,构建单链抗体(ScFv),进行原核表达,并对其功能进行鉴定.方法 从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA,逆转录成cDNA.在cDNA3'-OH末端添加poly-G.PCR扩增包括5'非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T-A载体测序.根据测序结果,设计引物分别扩增VH和VL编码区,再通过重叠PCR,在VH和VL编码区基因之间引入连接链,构建ScFv基因,并克隆到表达载体pComb3xSS中.重组载体导入E.coli Top10F'进行表达,重组蛋白经纯化后,分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性.结果 VH和VL编码区基因全长分别为396 bp和378 bp,ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达,表达产物的分子量为34 000,用NiSO4亲和层析柱成功纯化.功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合,能保护动物抵御毒素分子的攻击.结论 成功地克隆S2C4单抗可变区基因,并构建、表达其单链抗体ScFv,为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础.