克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

• 作者: 刘东军 梁燕 王彦凤 王志钢 王晓晶 王潇 王玮 郭旭东 金永
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 内蒙古白绒山羊 胸腺素β4 皮肤特异性表达载体 稳定转染
• 年，卷（期）: 2010,（21）
• 页码范围: 4497-4504
• 分类号: S8
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.21.020

摘要

[目的]克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β 4(thymosin beta 4,T β 4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆.[方法]通过RT-PCR克隆T β 4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT.外源表达载体以lipofectamineTM 2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合.[结果]克隆了内蒙古白绒山羊Tβ 4基因,eDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β 4(NM-001002885)同源性为100%.测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确.PCR检测显示外源KAP6-1启动子和T β 4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白.[结论]克隆得到内蒙古白绒山羊T β 4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β 4基因绒山羊提供了条件.