靶向人GSK-3β基因的shRNA真核表达质粒的构建及其在人胰腺癌细胞株PANC-1中的稳定表达

• 作者: 刘涛 勾善淼 周伟 汪理 王春友 王统林
• 来源期刊: 华中科技大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 胰腺癌 糖原合成激酶-3β 转染 RNA干扰 短发夹状RNA
• 年，卷（期）: 2011,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 142-146
• 分类号: R34
• 字数: 4263字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3870/j.issn.1672-0741.2011.02.004

摘要

目的 构建针对人糖原合成激酶-3β(GSK-3β)基因的shRNA真核表达质粒,并筛选基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体;转染人胰腺癌细胞株PANC-1,建立稳定表达GSK-3β shRNA的细胞模型.方法 针对GSK-3β基因的mRNA序列设计并分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠埃希菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,采用Real-time PCR检测GSK-3β mRNA被抑制情况.选取抑制效应最强的重组质粒和阴性质粒转染的PANC-1细胞,经G418筛选后,建立稳定表达GSK-3β-shRNA的PANC-1细胞株(实验组)和稳定表达control-shRNA的PANC-1细胞株(阴性对照组).分别采用荧光显微镜和流式细胞术观察细胞的转染情况;Real-time PCR和Western blot分析GSK-3β的表达.结果 ①经测序证实,成功构建GSK-3β-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致;②重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后,GSK-3β mRNA明显下调(P＜0.05),其中以2号重组质粒效应最强;③重组质粒稳定转染后检测PANC-1细胞中GSK-3β的表达,Real-time PCR和Western blot结果均提示:与未转染的阴性对照组和载体对照组比较,实验组中GSK-3β mRNA和蛋白的表达均显著降低(均P＜0.05).结论 成功构建了携带以GSK-3β为靶向的shRNA的重组质粒.经脂质体途径稳定转染PANC-1细胞,该shRNA能够显著抑制GSK-3β的表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王春友	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	244	1645	18.0	28.0
2	周伟	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	52	246	8.0	14.0
3	刘涛	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	136	733	13.0	20.0
4	勾善淼	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	27	57	4.0	6.0
5	汪理	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	15	22	2.0	3.0
6	王统林	华中科技大学同济医学院附属协和医院普通外科	1	1	1.0	1.0