pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化

• 作者: 刘岩 朱化彬 杜卫华 王宗礼 王帅 王栋 秦彤 赵学明 郝海生
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 绿色荧光蛋白 阳性细胞筛选 基因打靶 载体构建
• 年，卷（期）: 2011,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 711-718
• 分类号: S823
• 字数: 6133字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2011.04.017

摘要

绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键.本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272.采用LipofectamineTM (Lip)2000介导线性化质粒p EGFP-loxp-Lox22 72转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μL Lip 2000转染细胞的效果最理想；转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞.本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考.