橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

• 作者: 代龙军 曾日中 段翠芳 聂智毅 黎瑜
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 橡胶树 胶乳 均一化 全长cDNA文库
• 年，卷（期）: 2011,（4）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 683-690
• 分类号: S794.1
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.04.004

摘要

[目的]构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率.[方法]以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×10(6)cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库.[结果]胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%.定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍.[结论]构建T均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个.此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备.