柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

• 作者: 姜连连 平宪卿 朱顺海 李洋 董辉 赵其平 郭涛 韩红玉 黄兵
• 来源期刊: 西南大学学报（自然科学版）
• 学科: 农学
• 关键词: A08基因 柔嫩艾美耳球虫 荧光实时定量PCR 半赤酵母 表达
• 年，卷（期）: 2011,（6）
• 所属期刊栏目: 农业科学
• 页码范围: 19-24
• 分类号: S852.72+3
• 语种: 中文

摘要

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用Sac Ⅰ将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.