定向进化法提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性

• 作者: 冯雁 刘畅 张作明 田国贺 郑柏松
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 嗜热酯酶 定向分子进化 饱和突变 底物选择性
• 年，卷（期）: 2011,（12）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 1400-1404
• 分类号: Q556+1
• 语种: 中文

摘要

目的 提高嗜热酯酶对长链酰基酯的选择性,并分析该酶的底物选择性与酶结构的关系.方法 应用定向进化法,对APE1547突变体P01(APE1547/R526V)的催化结构域基因进行易错PCR后,与推进器结构域连接,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL,在双重选择压力下(高温及活性测定),应用高通量筛选方法筛选突变体,并针对特定的突变位点进行进一步饱和突变筛选,得到对长链酰基酯底物pNP-C12选择性提高的突变体酶.通过热稳定性测定、催化动力学分析和分子动力学模拟分析突变对酶结构和功能的影响.结果 从近万个随机突变体库中筛选到3株优势突变体,经测序得到4个氨基酸突变位点(379、394、489和560);对4个位点氨基酸分别进行饱和突变筛选,得到活性最高的突变体E01 (APE 1547/R526V/T560W),在80℃,P01和E01的半衰期分别为123和77 h;催化长链酰基酯底物pNPC-12的效率(kcat/Km)提高约14倍.分子动力学模拟分析表明,560位点突变可能阻碍底物pNP-C12沿次要通道进入酶分子内部.结论 定向进化结合饱和突变的方法可有效提高嗜热酯酶对长链酰基酯底物的活性和选择性；嗜热酯酶APE 1547内部的底物交通对酶的底物选择性具有重要影响,E01突变体通过显著改善pNP-C12在酶内部的底物交通提高了对pNP-C12的选择性,并对酶分子的稳定性有较大影响.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	刘畅	吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室	236	889	14.0	20.0
3	冯雁	吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室	28	349	9.0	18.0
5	张作明	吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室	7	26	3.0	5.0
8	田国贺	吉林省食品药品检验所化学室	2	15	1.0	2.0
9	郑柏松	吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室	2	1	1.0	1.0