生物素标记探针-液相杂交-非变性PAGE检测非编码小RNA方法的建立和优化

• 作者: 刘立宾 姜斌 徐芒华 李伟 郭竹英 郭跃辉 高丰厚
• 来源期刊: 国际检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 非编码小RNA 生物素化探针 液相杂交 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 所属期刊栏目: 基础实验研究论著
• 页码范围: 645-647
• 分类号: R346
• 字数: 3010字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-4130.2012.06.003

摘要

目的 建立生物素标记探针-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测非编码小RNA(sRNA)的方法.方法 将生物素标记的sRNA U6寡核苷酸探针经非变性PAGE电泳后转印至尼龙膜上,然后用辣根过氧化物酶(HRP)耦联链霉亲和素进行检测.从细胞中提取总RNA,用已标记U6探针优化液相杂交退火条件及杂交缓冲液;用建立的方法 检测并计算BEAS-2B、A549细胞中sRNA U6与miRNA145的含量.结果 将Biotin-11-dUTP成功标记至寡核苷酸上,随着寡核苷酸浓度增加,检测信号强度越强,10 μmol/L时达到最强.采用水浴反应条件与采用聚合酶链反应(PCR)仪梯次降温反应条件下得到的杂化链无明显差异;以磷酸盐缓冲液作为杂交缓冲液优于Tris-HCl、DEPC水;BEAS-2B、A549细胞5 μg RNA中U6含量接近;BEAS-2B细胞中miRNA145绝对含量高于A549细胞.结论 成功建立并优化了sRNA检测新方法,为简单、易行、可靠地检测sRNA提供了可能.