心脏发育候选基因PYGO1RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

• 作者: 刘宪楚 刘明 吴秀山 周军媚 宋文 廖四芳 李佑锋 王跃群 谢华平
• 来源期刊: 激光生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: PYGO1基因 RNA干扰 pSUPER H9c2
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 528-531,540
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 字数: 3138字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7146.2012.06.010

摘要

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER -PYGO1).首先,针对 PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSUPER 质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1.通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆.通过RT-PCR和Western blot检测pSUPER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果.pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染 pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低.因此,靶向PYGO1的 pSUPER RNAi 载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础.