Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选

• 作者: 何国锋 喻巍巍 庞实锋 张强 易文君 杨芳 莫玉叶 邹宇光 郑克勤
• 来源期刊: 贵阳医学院学报
• 学科: 医学
• 关键词: 绿色荧光蛋白 RNA干扰 基因融合
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 587-592
• 页数: 6页
• 分类号: R342.82
• 字数: 4347字
• 语种: 中文

摘要

目的:建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法.方法:通过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因,克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体,将人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A,shMpl-B,shMpl-C,shMpl-D,shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl-GFP真核载体中,构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体,然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法转染至293T细胞中,用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数,判定构建的RNA干扰载体对靶基因RNA的干扰效果.结果:构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效的基因敲减作用,在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E的干扰作用下,293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱,干扰效果较好,而其它两个效果较差；在这三个较好的干扰载体中,pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好.结论:成功构建Mpl基因的真核RNA干扰载体,并筛选出有效的RNA干扰片段.