穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装

• 作者: 周亚峰 李红霞 杨向军 程铖 蔡思达 赵欣 韩莲花
• 来源期刊: 苏州大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: HCN 4基因 穿梭质粒 慢病毒
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 方法与技术
• 页码范围: 354-358,437
• 分类号: R318|R541.7+205
• 语种: 中文

摘要

目的 将全长约3.6 kb的HCN 4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,建立稳定的HCN4重组慢病毒.方法 用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ从pCDNA3-HCN4质粒切下HCN4目的片段连接到Puc19载体中,再用EcoRⅠ和Hind Ⅲ从质粒Puc19切下目的片段并连接到pcDNA3.1(A)载体中,再用XbaⅠ单酶从质粒pcDNA3.1(A)双切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中.用XbaⅠ或者Eco R Ⅰ鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,慢病毒的包装参照SBI的Lentivector Expression System操作手册进行.将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞.结果 (1) XbaⅠ及Eco R Ⅰ鉴定表明,PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为3.6 kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN 4序列完全相同；构建的目的基因质粒转染293细胞和原代猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光出现.(2)构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞后,发现有强烈的绿色荧光出现,细胞感染率达90％以上.结论 (1)成功将全长HCN 4目的基因片段从pCDNA3-HCN 4质粒卸载下来,成功构建穿梭质粒pCDHI -MCS1 -EF1 -copGFP.(2)成功建立稳定的HCN 4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨向军	苏州大学附属第一医院心内科	307	1065	12.0	20.0
2	韩莲花	苏州大学附属第一医院心内科	42	127	6.0	8.0
3	李红霞	苏州大学附属第一医院心内科	108	405	9.0	15.0
4	周亚峰	苏州大学附属第一医院心内科	55	274	10.0	13.0
5	赵欣	苏州大学附属第一医院心内科	43	292	10.0	16.0
6	程铖	苏州大学附属第一医院心内科	6	8	2.0	2.0
7	蔡思达	南京大学生命科学学院	1	3	1.0	1.0