中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因剪接变异体的克隆及其在人类细胞中的表达

• 作者: 伍艳霞 刘美 曾养志 朱圣明 杨娅君 王宇 王竹 王艳萍 郑鸿
• 来源期刊: 四川大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 异种移植 中国近交系版纳微型猪 α1,3-半乳糖基转移酶 α-半乳糖基
• 年，卷（期）: 2012,（2）
• 页码范围: 145-150
• 分类号: R734.2
• 语种: 中文

摘要

目的 克隆中国近交系版纳微型猪(Chinese Banna Minipig Inbred Line,BMI)的α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)基因并分离其剪接变异体,构建其真核表达载体并观察BMI α1,3-GT基因在人肺腺癌A549细胞中的表达和功能.方法 提取BMI肝组织总RNA,RT-PCR扩增全长的α1,3-GT cDNA,并克隆到pMD18-T载体,挑选15个阳性克隆进行测序,获得GT1、GT2两种基因剪接变异体.将GT1、GT2克隆到pEGFP-N1上构建其真核表达载体,分别命名为pN-GT1、pN-GT2.将pN-GT1、pN-GT2分别转染人肺腺癌A549细胞,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达,倒置荧光显微镜和流式细胞术观察转染细胞上α-半乳糖基(α-Gal)的表达,流式细胞术检测人血清中IgM抗体和补体C3与转染细胞上α-Gal的结合.结果 在BMI中发现了碱基长度为1116bp和1080 bp的两个α1,3-GT基因剪接变异体,后者缺失了外显子5.pN-GT1或pN-GT2转染的A549细胞中,均检测到了α1,3-GT mRNA和α-Gal的表达,转染细胞膜上也检测到IgM和C3的沉积,且两种转染细胞中α-Gal的表达及IgM和C3的沉积没有差异(P＞0.05).结论 成功克隆了BMI的α1,3-GT基因,并发现两种α1,3-GT基因剪接变异体.两种基因剪接变异体转染的细胞中,均检测到α1,3-GT mRNA的表达且α1,3-GT能催化合成具有生物学效应的α-Gal,这为BMI用于异种移植中涉及α1,3-GT基因操作的研究提供了基因背景资料.