家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

• 作者: 何永盛 刘细霞 孙远明 杨武英 杨琼 王弘 董洁娴 陈舒迟 韩双艳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 生物学
• 关键词: 毕赤酵母 重组家蚕乙酰胆碱酯酶 表达 活性分析 有机磷农药 氨基甲酸酯类农药
• 年，卷（期）: 2012,（11）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 2189-2198
• 分类号: Q78
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.11.007

摘要

[目的]构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析.[方法]从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定.采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造,将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达.SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE(rBmAChE)的生物活性.[结果]改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1187 U·mg-1.抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50.值可达2.78×10-10 mol·L-1.[结论]成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂.