SHP-2酪氨酸磷酸酶野生、突变型真核表达载体构建及其表达产物磷酸酶活性检测

• 作者: 储著朗 李娟 李菲菲 查欣 汪心怡 汪思应 瞿成奎 胡中倩 邢小翠
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: SHP-2 蛋白酪氨酸磷酸酶 真核表达 突变
• 年，卷（期）: 2012,（7）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 767-771
• 分类号: R363
• 字数: 3922字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-1492.2012.07.004

摘要

目的 构建pcDNA3.1 SHP-2野生型(WT)及SHP-2D61G突变型(MT)真核表达载体,为研究SHP-2激活突变对肿瘤恶性生物学行为的影响提供基础.方法 用RT-PCR 及定点突变法从小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中扩增出目的片段,双酶切后定向连入 pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G/+真核表达质粒,经酶切、测序检测其构建的准确性;Western blot法检测转染 NIH3T3细胞中SHP-2蛋白的表达水平;免疫共沉淀法获得表达在NIH3T3细胞中的SHP-2蛋白,用 pNPP法检测其磷酸酶活性.结果 构建的pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G突变质粒经酶切初步检测后,测序检测发现MT SHP-2在181位核苷酸由WT的G突变为T,转染NIH3T3细胞株能够表达SHP-2蛋白;且转染MT的NIH3T3细胞株内SHP-2磷酸酶活性较WT组升高2倍(P<0.01).结论 成功构建了pcDNA3.1 SHP-2野生型及SHP-2D61G突变型真核表达载体,SHP-2D61G突变的蛋白磷酸酶活性升高.