黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建

• 作者: 孟敏 李晓燕 石引刚 董剑 赵万春 陈其皎 陈良国 高翔
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 奥地利栽培黑麦 Waxy蛋白 毛细管电泳 DuoFlow蛋白纯化系统 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
• 年，卷（期）: 2013,（21）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 4496-4505
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.21.012

摘要

[目的]构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的技术体系，为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及Waxy种质的快速筛选等提供理论参考。[方法]设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA中克隆获得Waxy，并进行体外表达；利用DuoFlow对籽粒蛋白提取物进行纯化，对峰值收集物、原核表达产物及其Ni柱纯化的重组Waxy蛋白进行SDS-PAGE分离，挖取蛋白条带进行MALDI-TOF质谱鉴定，结合经由基因序列所推导的氨基酸序列，确定回收产物的Waxy蛋白属性；在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy蛋白的毛细管电泳体系；同时，利用部分黑麦品种对DuoFlow及CE体系的有效性进行验证。[结果]核苷酸序列分析表明，从奥地利黑麦cDNA中克隆获得一条覆盖Waxy全长的编码序列（GenBank登录号：KF559182），其理论编码产物约为60 kD；利用DuoFlow Q1阳离子交换柱，以低浓度Tris-Hcl（20 mmol·L-1 Tris-Hcl，pH 9.5）进行蛋白挂柱，高浓度NaCl（20 mmol·L-1 Tris+1 mol·L-1 NaCl,pH 9.5）进行蛋白洗脱，214 nm波长检测，实现了对籽粒Waxy蛋白的DuoFlow高效分离；纯化产物的SDS-PAGE条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy蛋白序列相似性的统计结果表明，DuoFlow峰值回收产物具有黑麦Waxy亚基一致的特征序列，故属于Waxy蛋白；以DuoFlow纯化产物为标准样，以0.05 mmol·L-1硼砂+15%乙腈+1%SDS溶液(pH 9.5)为缓冲液，采用分离电压20 kV，温度25℃，检测波长214 nm，压力进样，0.5 psi×5 s，在11-12 min处获得峰值约12 mAU单一主峰，图形清晰，基线水平，从而构建了Waxy蛋白的CE鉴定体系，且籽粒Waxy蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测；同时，利用黑麦品种对上述体系的验证结果表明，DuoFlow及CE体系适于对Waxy亚基的高效分离与通量检测。[结论]从奥地利栽培黑麦cDNA文库中克隆获得Waxy完整编码序列，构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy蛋白的DuoFlow制备级纯化体系，并确立了黑麦籽粒Waxy亚基的毛细管快速鉴定体系。