4种楠木AFLP反应体系优化建立

• 作者: 吴小林 周生财 童再康 黄华宏
• 来源期刊: 浙江农林大学学报
• 关键词: 林木育种学 浙江楠 紫楠 桢楠 闽楠 DNA提取 AFLP
• 年，卷（期）: 2013,（5）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 789-796
• 页数: 8页
• 分类号: S722.3
• 语种: 中文

摘要

采用核酸电泳缓冲液(TNE)结合十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取的高质量楠木Phoebe基因组脱氧核糖核苷酸(DNA)可满足扩增片段长度多态性(AFLP)分析的要求.利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因组DNA优化建立楠木AFLP反应体系如下:酶切反应300 ng基因组DNA,0.3 μL缓冲液4,0.3 μL牛血清白蛋白(100×BSA),50 nkat EcoRⅠ,25 nkat MseⅠ,双蒸水加至30.0 μL放置37 ℃恒温箱酶切4h,聚合酶链式反应(PCR)仪上65℃15 min;连接反应20.0 μL酶切产物,2.5 μL T4缓冲液,666.8 nkat T4连接酶,5 pmol EcoRⅠ接头,10 pmol MseⅠ接头,双蒸水加至25.0 μL,16℃连接过夜(10 ～14 h);预扩增反应2.0 μL连接产物,2.0 μL 10×缓冲液,31.25 nmol镁离子,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,4 pmol脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),预扩增引物(E+A,M+C)各6 pmol,双蒸水加至20.0 μL;选扩增反应稀释40倍的预扩产物2.0 μL,2.0 μL 10×缓冲液,31.25 nmol镁离子,4 pmol dNTP,16.67 nkat TaqDNA聚合酶,选扩增引物(M+CNN)15 pmol,选扩增引物(E+ANN) 12 pmol,双蒸水加至20.0 μL.利用上面体系在64对选扩引物中筛出13对适于浙江楠AFLP分析的最佳引物组合.