沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化

• 作者: 周秀芬 安贤惠 梁晶丹 汪志军 邓子新
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: DNA磷硫酰化修饰 Salmonella enterica dpt基因簇 基因克隆与表达 蛋白质的分离纯化
• 年，卷（期）: 2013,（10）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1111-1116
• 分类号: Q933
• 语种: 中文

摘要

[目的]细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制.沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE.本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础.[方法]以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaⅠ和XhoⅠ位点之间,构建融合表达载体pJTU3622；将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆；提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[E.coli BL21 (DE3)pLysS],获得工程菌株Anxhl03；优化表达条件,诱导表达dptC基因；采用GST-Trap柱和Akata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白.[结果]获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxhl03；确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50 μmol/L Fe2+.[结论]成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达；表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础；沙门氏菌DptC发酵体系中添加50 μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	安贤惠	淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室	18	124	6.0	10.0
3	邓子新	上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室	50	323	8.0	17.0
4	周秀芬	上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室	9	53	4.0	7.0
5	汪志军	上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室	9	18	3.0	3.0
8	梁晶丹	上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室	5	9	2.0	2.0