绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定

• 作者: 林丹丹 王宜强 王斌 赵格
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 关键词: 绿脓杆菌 FlgE 原核表达载体 角膜上皮细胞 炎性因子
• 年，卷（期）: 2013,（2）
• 所属期刊栏目: 基础免疫学
• 页码范围: 112-116
• 页数: 5页
• 字数: 4878字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2013.02.009

摘要

目的 原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定.方法 分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列,设计带适当酶切位点的引物,用PCR方法扩增出 FlgE的编码DNA序列,与大肠杆菌表达载体pET24a同时经Nde Ⅰ/HindⅢ双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒,挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化,使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE对纯化后蛋白相对分子质量进行鉴定,用试剂盒进行去内毒素化处理.在体外培养人角膜上皮细胞系细胞,加入纯化的FlgE重组蛋白,培养4h后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性.结果 可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达,当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1 mmol/L,在16℃、225r/min振荡培养20 h,诱导目的蛋白表达量最高,经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE鉴定,获得纯化的重组FlgE蛋白.角膜上皮细胞用20 μg/ml FlgE处理后,细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升,而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性.结论 获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE,且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王斌	山东省医学科学院山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验室	11	41	4.0	5.0
2	赵格	山东省医学科学院山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验室	1	5	1.0	1.0