奶牛瘤胃微生物元基因组文库中二肽基肽酶Ⅳ的筛选与分析

• 作者: 卜登攀 卢玉飞 孙鹏 王丹丹 王加启 胡小丽 赵圣国 赵静雯 金迪
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 瘤胃微生物 Fosmid文库 二肽基肽酶Ⅳ 末端序列 酶活性
• 年，卷（期）: 2013,（8）
• 所属期刊栏目: 畜牧·资源昆虫
• 页码范围: 1687-1693
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.08.019

摘要

[目的]研究奶牛瘤胃内参与蛋白质降解过程中二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidasesⅣ,DPP-Ⅳ)的序列特征和酶学性质.[方法]从奶牛瘤胃微生物Fosmid文库中挑选17 664个克隆,利用dpp-Ⅳ简并引物筛选含dpp-Ⅳ的阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,用限制性内切酶HindⅢ进行酶切.PCR扩增含dpp-Ⅳ目的片段,并克隆测序.对阳性克隆的Fosmid末端进行测序.提取阳性克隆粗酶液,利用底物Gly-Pro-pNA检测肽酶活性.[结果]筛选后获得10个合有dpp-Ⅳ的阳性克隆(命名为DP1-DP10).Fosmid末端序列经BLASTX比对后发现78％的序列可以与数据库的已知序列相匹配,但相似度变化较大(44％-94％).DPP-Ⅳ序列经BioEdit比对后,发现均含有N端保守区域(DWVYEEE)和C端催化区域(GWSYGG),经BLASTP比对发现阳性克隆的DPP-Ⅳ分别与Cyclobacterium marinum(43％)、Capnocytophaga sp.(63％)、Prevotella ruminicola 23 (66％)和Solitalea canadensis (50％)的DPP-Ⅳ相似度高.酶活力检测发现DP7肽酶活力最高,为6.88 U·mg-1.[结论]从瘤胃微生物Fosmid文库中获得了10个含有dpp-Ⅳ的阳性克隆,它们具有不同的dpp-Ⅳ序列特征和肽酶活性.