利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质

• 作者: 刘琳 李静 梅香寒 王晓敏 程剑松 谢小丽
• 来源期刊: 中国生物工程杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 原核表达 生物素标记 己糖苷酶D
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 36-41
• 分类号: Q563
• 语种: 中文
• DOI: 10.13523/j.cb.20140106

摘要

传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法,涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理,该方法步骤繁琐,且对目的蛋白的损失较大.本实验利用原核共表达质粒pCDFDuet-1,将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶D(hexosaminidase D,HexD)的cDNA与生物素受体多肽(biotin acceptor peptide,BAP) DNA进行PCR拼接,连入pCDFDuet-1的多克隆位点1(multiple cloning site1,MCS1);将以大肠杆菌Trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶(biotin ligase,BirA)基因连入MCS2,构建重组质粒pCDFDuet-hexD-BAP-birA.初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中,利用0.1 mmol/L的IPTG和80 μmol/L的生物素进行诱导表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤对HexD进行纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(60 kDa)和纯度(90％以上).以anti-HexD和链霉亲和素-HRP为抗体,Western blot检测发现,HexD-BAP表达正确,且被生物素标记;同时以4-MU-O-GalNAc为荧光底物,检测到生物素化标记HexD的糖苷酶活性为3.6 nmol/(min· μg),与未标记HexD的活性(3.06 nmol/(min·μg))相当.结果表明,可以利用BirA及其受体多肽,通过共表达质粒pCDFDuet-1,一步转化、表达和纯化,在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记,且不改变目的蛋白的生物活性,可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李静	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	61	310	10.0	14.0
3	刘琳	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	14	157	6.0	12.0
4	程剑松	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	4	10	2.0	3.0
5	王晓敏	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	3	3	1.0	1.0
6	谢小丽	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	2	3	1.0	1.0
7	梅香寒	南开大学药学院天津市分子药物研究重点实验室	1	3	1.0	1.0