利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

• 作者: 令利军 张正英 李淑洁 李静雯
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 大麦 B醇溶蛋白基因 蛋白质含量 RNAi
• 年，卷（期）: 2014,（19）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 3746-3756
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.003

摘要

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达，获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质，探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列，通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4，利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚，获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量，并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测，以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验，检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5），测序结果表明该片段大小为349 bp，聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%，与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%，确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207，反向重复序列用i18和 iv2 intron连接，构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordeinRNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚，结合目标基因及筛选标记基因的 PCR 验证，获得含有 RNAi 构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T2/T3转基因大麦基因组。随机选取6个T3转基因大麦株系，半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照，20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%，而且在各时期中也最低。利用随机选取的 T1和T3籽粒进行蛋白质含量测定表明8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低，SDS-PAGE 电泳结果显示与非转基因相比，转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低，其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显，平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系 RNAi-20开展氮肥运筹试验，结果表明，高氮肥水平 HN2及 HN3处理，该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照；施以等量高氮肥时，伴随氮肥后移（HN2到HN3），该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低，电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达，降低B-醇溶蛋白含量，高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	张正英	甘肃省农业科学院科研管理处	58	409	11.0	18.0
2	李淑洁	甘肃省农业科学院生物技术研究所	26	108	6.0	9.0
3	李静雯	甘肃省农业科学院生物技术研究所	24	53	5.0	6.0
4	令利军	西北师范大学生命科学学院	17	87	6.0	9.0