RT-PCR-RFLP方法鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒

• 作者: 伍锐 刘瀚扬 张亮 文心田 文翼平 田耕 石双艳 袁磊 黄小波
• 来源期刊: 畜牧兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 日本脑炎病毒 反转录-聚合酶链反应限制性片段长度多态性 基因Ⅰ型 基因Ⅲ型 鉴别
• 年，卷（期）: 2014,（9）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 1555-1560
• 页数: 6页
• 分类号: S852.659.6
• 字数: 4927字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2014.09.025

摘要

建立一种可检测及鉴别基因Ⅰ型和基因Ⅲ型日本脑炎病毒(JEV)的RT PCR-RFLP方法.通过对JEV基因Ⅰ型(GⅠ)和基因Ⅲ型(GⅢ)核酸序列的比对分析,设计1对特异性引物对JEV C-PrM E区域部分基因进行RT PCR扩增,扩增产物经限制性内切酶Spe Ⅰ消化后于15 g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行RFLP分析,并利用建立的RT PCR-RFLP方法对78份临床样品进行了JEV的检测及基因型鉴定.结果显示,特异性引物可扩增出长为819 bp的片段,而对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及猪伪狂犬病毒的核酸扩增结果均为阴性.经SpeⅠ酶切,基因Ⅰ型JEV RT-PCR产物被切为568和251 bp 2个条带,基因Ⅲ型JEV RT-PCR产物被切为446、251和122 bp 3个条带,基因Ⅰ型和基因Ⅲ型JEV混合RT-PCR产物被切为568、446、251和122bp 4个条带,该方法最低可检出1.5 pg·μL-1的JEV RNA.RT-PCR-RFLP结果显示78份临床样品中有14份为JEV阳性,其中6份为基因Ⅰ型,8份为基因Ⅲ型,与核苷酸测序分析结果一致.本研究为日本脑炎病毒的实验室诊断及基因Ⅰ型和基因Ⅲ型的鉴别提供了一种快速有效的分子生物学方法.