副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性

• 作者: 周冬生 张义全 杨瑞馥 王丽 胡小许 钟青萍 黄倩 黎晓敏
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 医学
• 关键词: 副溶血弧菌 ToxR DNA结合活性 转录调控
• 年，卷（期）: 2014,（8）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 956-961
• 分类号: R392
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.2014.08.015

摘要

[目的]利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础.[方法]以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆人pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导人大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白.利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的caIR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性.分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(△toxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系.[结果]成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性.LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用.[结论]所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达.