铜绿假单胞菌外毒素A基因突变体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

• 作者: 姚立红 尉玉杰 张智清 徐一 薄洪 郭建强 陈爱珺
• 来源期刊: 中国生物制品学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 铜绿假单胞菌 外毒素 基因 突变体 原核细胞 基因表达
• 年，卷（期）: 2014,（1）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 23-27
• 分类号: R378.99+1|Q786
• 语种: 中文

摘要

目的 将铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)基因突变为无毒性的ntPE基因,并在大肠埃希菌中进行表达.方法 利用Primer Premier 5.0软件设计PEA基因引物及PEA基因第553位氨基酸缺失的突变引物,以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)基因组DNA为模板,PCR扩增PEA基因,插入pGEM-T载体中,构建重组克隆质粒pGEM-PEA,以其为模板,利用突变引物,扩增ntPE基因(无毒性PEA),插入pET-30a载体中,构建原核表达质粒pET-ntPE,转化大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westem blot分析.结果 测序结果证明已成功获得突变基因;原核表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约69 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30％,可被小鼠抗PEA单克隆抗体特异性识别,具有较好的抗原性.结论 已成功获得无毒性的PEA突变基因,为构建以PEA为蛋白佐剂的融合蛋白疫苗奠定了基础.